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曲酸的发酵培养基及提存方法

微生物技术应用2020-04-28 04:38:30

曲酸最早从米曲抽提液中发现。曲酸为无色棱柱晶体,熔点在151-153℃,易溶于水、丙酮与醇,微溶于乙醚、乙酸乙酯、氯仿及吡啶,不溶于苯。曲酸广泛用于增香剂、杀虫抗菌剂、铁分析试剂、胶片去斑剂等。近年来发现,曲酸能消除人体内的自由基,增强细胞免疫力,抑制皮肤黑色素的生成;另外,曲酸有很好的食品保鲜防腐作用,它易溶于水,具有较强和广泛的抗菌能力和良好的热稳定性;曲酸可与食品共同加热,对人体无刺激,并可抑制亚硝酸盐生成致癌物。曲酸是较理想的多酚氧化酶抑制剂,对水果、蔬菜有着显著的护色效果,且不影响食品的口味、香味及质感。因此,曲酸被广泛用于化妆品和作为食品添加剂。

曲酸是曲霉属中某些菌株好氧发酵产生的有机酸,利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醇等为原料,通过微生物发酵法可以生产曲酸。目前发酵法生产曲酸的方法有静态培养法、通风发酵法、固定化细胞技术等,但曲酸发酵都面临着生产效率低,发酵速度慢,产品成本高,难以大规模工业化生产等问题。

曲酸发酵培养基

马铃薯固体培养基;葡萄糖液体培养基 葡萄糖 10%、 酵母膏 0.2% 、MgSO4•7H2O 0.05%,K2PO4 0.1% 、pH6.0 ,121℃灭菌 20分钟;淀粉液体培养基用淀粉取代葡萄糖液体培养基中的葡萄糖,其他成分不变,分别配成 6%、8%、10%、14%的淀粉液体培养基,pH6.0,121℃灭菌 20分钟;

曲酸发酵设备

WDP型微生物多用培养箱,,721型分光光度计,高压蒸汽灭菌器等。

曲酸发酵条件及提存方法

1、菌种的分离及纯化 

取土壤样品进行适当的稀释后,用涂布接种法接种在马铃薯培养基平板上,30℃恒温培养3-5天。待平板上有菌落生长时,根据菌落形态及显微镜观察分生孢子穗形态和足细胞有无等进行鉴定后,挑取单个曲霉菌落菌丝或孢子,接种到另一新鲜的马铃薯培养基平板上进行纯化,直到获得该菌株的纯培养后接种到斜面马铃薯培养基试管中,30℃恒温培养到孢子成熟后,置于4℃冰箱中待用。在进行分离纯化时,为了抑制土壤中的细菌生长,在灭菌后的培养基中加入适量的链霉素和青霉素。

2 曲酸发酵 

将上述分离的米曲霉菌株分别接种到含有 20ML/250ML 无菌葡萄糖液体培养基的三角瓶中,置于30℃摇床上恒温震荡培养 48小时后转接到含有 100ML/500ML 无菌葡萄糖液体培养基的三角瓶中,接种量为10%,30℃,转速 200r/min,振荡培养5天。

3 曲酸的测定 曲酸测定采用标准曲线法。

准确称取曲酸标准样品 0.100g,溶解于蒸馏水中,定容至 100ML,配制成 1mg/ml 的曲酸标准溶液。

配制 1% FeCl3-HCl溶液 准确称取 1.00g FeCl3,溶解于蒸馏水中,滴入数滴浓硫酸后定容至 100ml。

分别取2ml 1% FeCl3-HCl显 色 剂 于 10 支100ml 容量瓶中,然后分别加 入 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ml 曲酸标准液,用蒸馏水定容至 100ml。摇匀后在721 分光光度计波长 500nm处进行比色测定,制出标准曲线。

发酵液中曲酸含量的测定 发酵液过滤去除菌丝,将发酵液进行适当稀释后取 1ml 加 2ml 1% FeCl3-HCl显色剂,用蒸馏水定容至 100ml。以 2ml 显色剂用蒸馏水定容至 100ml 为空白,摇匀后置于721 分光光度计 500nm 处进行比色测定,对照标准曲线计算出曲酸含量。每个菌株做三次重复实验,取平均值。

4 曲酸发酵条件优化研究

4.1 不同碳源对曲酸发酵的影响 在保持其他成分不变的情况下,分别用 10%淀粉、10%蔗糖代替葡萄糖为碳源,进行曲酸发酵。

4.2 淀粉浓度对曲酸发酵的影响 分别以 8%、10%、12%、14%的淀粉培养基进行曲酸发酵。

4.3 氮源对曲酸发酵的影响 在 8%的淀粉培养基中,分别以不同浓度的酵母膏、NH4NO3 为氮源,进行曲酸发酵。

4.4 发酵时间对曲酸产量的影响 8%的淀粉培养基,发酵时间分别为 4、5、6、7、8天后进行曲酸含量测定。


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